二氫乙錠可有效地作為測量活性氧物質(zhì)的探針。染料自由進入細胞并脫氫成溴化乙錠。該探針已被廣泛用于NK細胞，并作為鑒定腫瘤中增殖和缺氧細胞的重要染料。已經(jīng)使用嗜中性粒細胞和內(nèi)皮細胞以及HL60細胞和巨噬細胞進行了研究。該探針的主要優(yōu)點是能夠區(qū)分超氧化物和H₂O_2,熒光發(fā)射發(fā)生在約600nm處。

用于染色細胞的樣品方案

以下過程提供了一般準則，實際情況應根據(jù)您的特定實驗進行修改。

1.制備5-10 mM DMSO儲備溶液。應將未使用的DMSO儲備溶液等分到單次使用的小瓶中并儲存在-20℃，避光。

2.在生理緩沖液（如PBS，HBSS，HEPES）中使染料的工作濃度為5-20μM。最佳工作濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

3.將染料工作溶液（來自步驟2）等體積（例如100μL細胞在生長培養(yǎng)基中）加入細胞中，并在室溫或37℃下孵育細胞5至60分鐘。

4.在將細胞暴露于實驗誘導物之前，確定負載細胞樣品的基線熒光強度。

5.陰性對照應評估如下：

5.1檢查有沒有誘導物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無細胞混合物的熒光。 在沒有細胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，熒光隨時間的逐漸增加可能會自發(fā)水解，導致水解的原因可能與大氣氧化或光誘導氧化有關(guān)。

5.2檢查已經(jīng)保持在生長培養(yǎng)基或緩沖液中的未處理（對照）負載細胞的熒光。在健康細胞中，氧自由基被細胞酶和天然抗氧化劑消除。 在染料加載結(jié)束后，健康細胞應表現(xiàn)出低水平的熒光，在實驗期間相對穩(wěn)定; 可以觀察到熒光的逐漸增加（由于自動氧化）或減少（由于細胞中的染料損失或光漂白）。在沒有任何刺激或誘導的情況下，健康的未經(jīng)處理的細胞中的熒光突發(fā)可以指示細胞死亡或一些其他氧化事件的進展。

6.可以用叔丁基過氧化氫（TBHP）刺激陽性對照至終濃度~100μM（基于細胞的敏感性和反應增加或減少劑量而定）。